Pipette คืออะไร? และวิธีการใช้งานที่ถูกต้อง เพื่อให้ปริมาตรที่จ่ายมีความน่าเชื่อถือ

Pipette เป็นเครื่องมือสำหรับดูดและจ่ายของเหลวในปริมาตรที่กำหนด พบได้ทั่วไปในห้องปฏิบัติการทางเคมี ชีววิทยา การแพทย์ อาหาร ยา และงานวิจัย

โดยเฉพาะ Micropipette หรือ Piston Pipette ซึ่งใช้สำหรับของเหลวปริมาตรค่อนข้างน้อย เช่น µL หรือ mL การใช้งานที่ดูเหมือนง่าย เช่น “กด–ดูด–จ่าย” จริง ๆ แล้วมีหลายปัจจัยที่สามารถทำให้ปริมาตรคลาดเคลื่อนได้ ตั้งแต่การเลือกช่วงปริมาตร การใส่ Tip การกด Plunger ความลึกในการจุ่ม Tip ไปจนถึงอุณหภูมิและคุณสมบัติของของเหลว

ISO 8655-1:2022 กำหนดข้อกำหนดทั่วไปและคำแนะนำสำหรับอุปกรณ์วัดปริมาตรแบบลูกสูบ ส่วน ISO 8655-2:2022 ครอบคลุม Pipette แบบ Air-displacement และ Positive-displacement ทั้งแบบ Single-channel และ Multi-channel ค่ะ

Pipette คืออะไร?

Pipette คือเครื่องมือที่ใช้สำหรับ ดูดและจ่ายของเหลวในปริมาตรที่กำหนด

สำหรับ Piston Pipette ที่ใช้กันทั่วไป จะอาศัยการเคลื่อนที่ของลูกสูบเพื่อสร้างความแตกต่างของความดันและควบคุมปริมาตรของของเหลว

ISO 8655-2:2022 ครอบคลุมข้อกำหนดด้านมาตรวิทยา Maximum Permissible Errors การทำเครื่องหมาย และข้อมูลสำหรับผู้ใช้ของ Pipette ที่ออกแบบมาเพื่อจ่ายปริมาตรที่เลือกค่ะ

Micropipette คืออะไร?

Micropipette เป็น Pipette สำหรับจ่ายของเหลวปริมาตรค่อนข้างน้อย โดยทั่วไปจะแสดงหน่วยเป็น

µL — microlitre

เช่น

P20
P200
P1000

แต่ชื่อและช่วงปริมาตรจริงแตกต่างกันตามผู้ผลิตและรุ่น

ตัวอย่างเช่น Pipette ตัวหนึ่งอาจมีช่วง

20–200 µL

ไม่ได้หมายความว่า Pipette ทุกยี่ห้อที่เรียกว่า P200 จะมี Specification เหมือนกันทั้งหมด จึงควรตรวจ Datasheet ของรุ่นจริงเสมอค่ะ

Pipette มีกี่ประเภท?

สำหรับ Piston Pipette ที่พบได้บ่อย สามารถแบ่งแนวคิดหลักได้เป็น Air-displacement และ Positive-displacement โดย ISO 8655-2:2022 ครอบคลุมทั้งสองประเภทค่ะ 

Air-displacement Pipette ใช้ชั้นอากาศระหว่างลูกสูบกับของเหลวใน Tip การเปลี่ยนแปลงของอากาศจึงมีผลต่อปริมาตรที่ดูดและจ่าย

Positive-displacement Pipette ให้ลูกสูบสัมผัสกับระบบของเหลวโดยตรงมากกว่า และมักเหมาะกับของเหลวบางชนิดที่มีคุณสมบัติแตกต่างจากน้ำมาก เช่น ของเหลวหนืดหรือระเหยง่าย ทั้งนี้ต้องเลือกตามคำแนะนำของผู้ผลิตค่ะ

Fixed Volume กับ Variable Volume ต่างกันอย่างไร?

Fixed Volume Pipette จ่ายปริมาตรเดียว เช่น 100 µL

ส่วน Variable Volume Pipette สามารถปรับปริมาตรได้ภายในช่วงที่ผู้ผลิตกำหนด เช่น 20–200 µL

ข้อดีของ Variable Volume คือยืดหยุ่นกว่า แต่ผู้ใช้งานต้องระวังไม่ปรับปริมาตรเกินช่วงที่กำหนด เพราะอาจทำให้กลไกเสียหายหรือผลการจ่ายปริมาตรผิดปกติค่ะ

ทำไมต้องเลือก Pipette ให้ตรงกับปริมาตร?

สมมติต้องจ่าย

20 µL

ไม่ควรเลือก Pipette เพียงเพราะ “ปรับเลข 20 ได้”

ควรตรวจว่า 20 µL อยู่ตรงส่วนใดของ Operating Range และ Specification ของ Pipette รุ่นนั้นเป็นอย่างไร

โดยทั่วไป การเลือก Pipette ที่มีช่วงปริมาตรเหมาะกับงานจะช่วยให้ควบคุม Error และ Repeatability ได้ดีกว่าการใช้เครื่องมือที่ต้องทำงานใกล้ขอบเขตของช่วงโดยไม่จำเป็น

ดังนั้นก่อนเริ่มงานควรถามว่า

ปริมาตรที่ต้องการจ่ายอยู่ในช่วงที่ Pipette ถูกออกแบบไว้หรือไม่?

Pipette Tip สำคัญอย่างไร?

Tip เป็นส่วนหนึ่งของระบบ Pipette

ไม่ควรมองว่า Tip เป็นเพียงภาชนะรองรับของเหลว

ISO 8655-2 กล่าวถึง Pipette ในฐานะระบบที่ใช้งานร่วมกับ Selected Tip และ Consumable Parts ที่จำเป็นต่อการจ่ายปริมาตรค่ะ

Tip ที่ไม่พอดีอาจทำให้

• เกิดการรั่วของอากาศ
• ดูดของเหลวไม่ครบ
• ปริมาตรไม่สม่ำเสมอ
• Repeatability แย่ลง

ดังนั้นควรใช้ Tip ที่ผู้ผลิตระบุว่าเหมาะกับ Pipette รุ่นนั้นค่ะ

วิธีใช้ Pipette อย่างถูกต้อง

สำหรับ Air-displacement Micropipette แบบทั่วไป หลักการใช้งานพื้นฐานมีดังนี้ แต่ควรยึดคู่มือของรุ่นจริงเป็นหลัก เพราะโครงสร้างและวิธีใช้อาจแตกต่างกันค่ะ

1. เลือก Pipette ให้เหมาะกับปริมาตร และตั้งค่าภายในช่วงที่ผู้ผลิตกำหนด
2. ติด Tip ให้แน่นและถูกประเภท โดยไม่ใช้แรงเกินจำเป็น
3. Pre-wet Tip โดยดูดและจ่ายของเหลวเดิมประมาณ 2–3 ครั้งเมื่อวิธีงานเหมาะสม เพื่อช่วยปรับสภาพภายใน Tip
4. กด Plunger ถึง First Stop ก่อนจุ่ม Tip แล้วจุ่มปลาย Tip ลงในของเหลวในระดับที่เหมาะสม
5. ปล่อย Plunger อย่างช้าและสม่ำเสมอ พร้อมถือ Pipette ในแนวใกล้เคียงแนวดิ่งระหว่างการดูด และรอให้ของเหลวเข้าสู่ Tip อย่างเสถียรก่อนยกขึ้น
6. จ่ายของเหลวโดยแตะ Tip กับผนังภาชนะตามวิธีที่เหมาะสม กดถึง First Stop และสำหรับ Pipette ที่ออกแบบลักษณะนี้ให้กดต่อถึง Second Stop เพื่อช่วยจ่ายของเหลวที่เหลือ ก่อนถอน Tip และปล่อย Plunger กลับ
7. ทิ้ง Tip อย่างเหมาะสม และเปลี่ยน Tip เมื่อเปลี่ยนตัวอย่างหรือเมื่อต้องป้องกันการปนเปื้อน

ISO 8655-10:2024 ให้คำแนะนำเกี่ยวกับการเลือกและการใช้อุปกรณ์ Piston-operated Volumetric Apparatus ตลอดจนความสามารถและการฝึกอบรมผู้ใช้งาน ซึ่งสะท้อนว่าเทคนิคของผู้ปฏิบัติงานเป็นส่วนสำคัญของผลการจ่ายปริมาตรค่ะ

First Stop กับ Second Stop คืออะไร?

Pipette แบบ Air-displacement หลายรุ่นมีการกด Plunger สองระดับ

First Stop ใช้กำหนด Stroke สำหรับปริมาตรที่ตั้งไว้

Second Stop หรือ Blow-out ใช้ช่วยจ่ายของเหลวส่วนที่เหลือใน Tip ในขั้นตอนการ Dispense สำหรับ Pipette/วิธีที่ออกแบบให้ใช้งานลักษณะนี้

จุดที่ผิดพลาดบ่อยคือ

กดจนถึง Second Stop ก่อนดูดของเหลว

สำหรับ Forward Pipetting แบบทั่วไป การทำเช่นนั้นอาจทำให้ดูดของเหลวมากกว่าปริมาตรที่ต้องการค่ะ

อย่างไรก็ตาม ต้องยึดคู่มือของ Pipette รุ่นจริง เพราะระบบ Pipette และเทคนิค เช่น Reverse Pipetting มีวิธีการต่างกันค่ะ

ทำไมต้อง Pre-wet Tip?

การดูดและจ่ายของเหลวซ้ำก่อนเริ่มวัดจริงช่วยปรับสภาวะภายใน Tip ให้สม่ำเสมอขึ้นสำหรับงานบางประเภท

โดยเฉพาะ Air-displacement Pipette ซึ่งมีชั้นอากาศระหว่างลูกสูบและของเหลว

หากดูดครั้งแรกทันทีโดยไม่ปรับสภาพ อุณหภูมิและการระเหยภายในระบบอาจแตกต่างจากการดูดครั้งต่อ ๆ ไป

แต่จำนวนครั้งและความจำเป็นของ Pre-wetting ควรอ้างอิง Procedure และคำแนะนำของผู้ผลิตค่ะ

จุ่ม Tip ลึกแค่ไหน?

ไม่ควรจุ่มลึกเกินความจำเป็น

ถ้าจุ่มลึกมาก

ความดันของของเหลวที่ปลาย Tip และของเหลวที่เกาะผิวด้านนอกอาจมีผลต่อปริมาตร

แต่ถ้าจุ่มตื้นเกินไป

อาจดูดอากาศเข้า Tip

ความลึกที่เหมาะสมขึ้นอยู่กับ

Tip + Volume + Pipette + Liquid

จึงควรยึดคู่มือของผู้ผลิตมากกว่ากำหนดระยะเดียวสำหรับ Pipette ทุกแบบค่ะ

ทำไมต้องถือ Pipette ใกล้แนวดิ่งตอนดูด?

โดยเฉพาะ Air-displacement Pipette การเอียง Pipette ระหว่าง Aspirating สามารถเปลี่ยนความสัมพันธ์ของแรงดันและระดับของเหลวได้

จึงควรรักษาแนวการดูดตามคำแนะนำของผู้ผลิต และหลีกเลี่ยงการเอียงมากโดยไม่จำเป็น

ส่วนขั้นตอน Dispense อาจใช้มุมต่างออกไปตาม Technique และภาชนะค่ะ

การปล่อย Plunger เร็วเกินไปมีผลหรือไม่?

มีผลค่ะ

หากปล่อย Plunger เร็วเกินไป

ของเหลวอาจ

• • พุ่งเข้าสู่ Tip อย่างรวดเร็ว
  • เกิดฟองอากาศ
  • กระเด็นเข้าสู่ส่วนภายในของ Pipette
  • ทำให้ปริมาตรไม่สม่ำเสมอ

โดยเฉพาะของเหลวหนืด

ควรควบคุม Plunger อย่างนุ่มนวลและสม่ำเสมอค่ะ

Temperature มีผลต่อ Pipette หรือไม่?

มีผล โดยเฉพาะ Air-displacement Pipette

ความแตกต่างของอุณหภูมิระหว่าง

Pipette + Tip + Liquid + Environment

สามารถส่งผลต่อชั้นอากาศในระบบ และความหนาแน่นของของเหลว

ในการสอบเทียบด้วยวิธี Gravimetric อุณหภูมิและสภาพแวดล้อมก็มีความสำคัญ เพราะการหาปริมาตรอาศัยมวลของของเหลวและข้อมูลที่เกี่ยวข้องกับความหนาแน่น ISO 8655-6:2022 กำหนด Gravimetric Reference Measurement Procedure สำหรับการหาปริมาตรของอุปกรณ์ Piston-operated Volumetric Apparatus ค่ะ

ของเหลวแต่ละชนิด Pipette เหมือนกันได้หรือไม่?

ไม่เสมอไปค่ะ

คุณสมบัติของของเหลว เช่น

• • ความหนืด
  • ความระเหย
  • Surface Tension
  • Density
  • Temperature

สามารถทำให้พฤติกรรมการดูดและจ่ายแตกต่างกัน

น้ำจึงไม่จำเป็นต้องให้พฤติกรรมเหมือนกับของเหลวหนืดหรือระเหยง่าย

ในบางกรณีอาจต้องใช้

Reverse Pipetting

หรือ Positive-displacement Pipette

ตาม Method และคำแนะนำของผู้ผลิตค่ะ

Forward Pipetting กับ Reverse Pipetting ต่างกันอย่างไร?

Forward Pipetting เป็นวิธีทั่วไปสำหรับของเหลวคล้ายน้ำ โดยดูดปริมาตรที่กำหนดและจ่ายจนถึง Blow-out ตามระบบของ Pipette

Reverse Pipetting ใช้เทคนิคที่เก็บของเหลวส่วนเกินไว้ใน Tip และจ่ายเฉพาะส่วนที่กำหนด มักถูกนำมาใช้กับของเหลวบางประเภท เช่น ของเหลวที่มีความหนืดหรือมีแนวโน้มเกิดฟอง

ไม่ควรเปลี่ยน Technique โดยไม่มี Procedure รองรับ เพราะวิธีที่ต่างกันอาจให้ผลต่างกันค่ะ

ข้อผิดพลาดที่พบบ่อยในการใช้ Pipette

สิ่งที่พบได้บ่อย ได้แก่ การเลือกช่วง Pipette ไม่เหมาะสม, Tip ไม่แน่นหรือไม่ตรงรุ่น, ไม่ Pre-wet เมื่อวิธีกำหนด, กดถึง Second Stop ก่อน Aspirate, ปล่อย Plunger เร็วเกินไป, ถือ Pipette เอียงมากขณะดูด, จุ่ม Tip ลึกเกินไป, มีฟองอากาศใน Tip, ใช้ Tip เดิมกับหลายตัวอย่าง และใช้ Pipette ต่อทั้งที่ตกหรือกระแทก

ข้อผิดพลาดเหล่านี้อาจเพิ่มทั้ง Systematic Error และ Random Error ของการจ่ายปริมาตรค่ะ

หลังใช้งาน Pipette ควรทำอย่างไร?

หลังใช้งานควร

• • Eject Tip
  • ตรวจว่ามีของเหลวเข้าสู่ Shaft หรือไม่
  • ทำความสะอาดตามคู่มือ
  • เก็บ Pipette ตั้งใน Stand ตามคำแนะนำผู้ผลิต
  • ไม่วาง Pipette ราบโดยมีของเหลวอยู่ใน Tip
  • ตรวจการปนเปื้อนหากใช้กับสารที่มีความเสี่ยง
  • บันทึกความผิดปกติหากพบ

การดูแลที่เหมาะสมช่วยลดความเสี่ยงต่อ Seal, Piston และกลไกภายในค่ะ

Pipette ต้องสอบเทียบหรือไม่?

หาก Pipette ใช้สำหรับงานที่ปริมาตรมีผลต่อคุณภาพของผลวิเคราะห์ ก็ควรมีระบบควบคุมที่เหมาะสม

การสอบเทียบช่วยประเมินว่าปริมาตรที่ Pipette จ่ายจริงสัมพันธ์กับค่าที่ตั้งไว้อย่างไร

ISO 8655-2:2022 กำหนดข้อกำหนดทางมาตรวิทยาสำหรับ Pipette ส่วน ISO 8655-6:2022 กำหนด Gravimetric Reference Measurement Procedure สำหรับการหาปริมาตร และ ISO 8655-8:2022 ระบุ Photometric Reference Measurement Procedure สำหรับระบบที่อยู่ในขอบเขตมาตรฐานค่ะ

การสอบเทียบ Pipette แบบ Gravimetric ทำอย่างไร?

หลักการโดยย่อคือ

Pipette จ่ายน้ำ → ชั่งมวลน้ำ → ใช้ข้อมูลที่เกี่ยวข้องเพื่อแปลงเป็นปริมาตร

จึงต้องควบคุมและพิจารณาปัจจัย เช่น

อุณหภูมิของน้ำ
อุณหภูมิอากาศ
ความชื้น
ความดันบรรยากาศ
การระเหย
ความละเอียดและสมรรถนะของเครื่องชั่ง

ISO 8655-6:2022 กำหนดวิธีอ้างอิงแบบ Gravimetric สำหรับการหาปริมาตรของ POVA โดยเฉพาะค่ะ

ควรสอบเทียบ Pipette ที่ปริมาตรใด?

ควรเลือก Calibration Point ให้สอดคล้องกับประเภท Pipette วิธีมาตรฐาน Requirement และช่วงการใช้งาน

ไม่ควรเลือกเพียงจุดเดียวแล้วสรุปสมรรถนะของ Variable Pipette ทั้ง Range หากวิธีที่ใช้กำหนดให้ตรวจหลายระดับ

การกำหนดจุดจริงควรอ้างอิง ISO 8655 ที่เกี่ยวข้อง รวมถึง Procedure ของห้องปฏิบัติการค่ะ

Accuracy และ Precision ของ Pipette ต่างกันอย่างไร?

ในทางปฏิบัติสามารถเข้าใจง่าย ๆ ว่า

Accuracy / Systematic Error
ดูว่าค่าเฉลี่ยที่จ่ายออกมาแตกต่างจากค่าที่ตั้งไว้เท่าไร

Precision / Random Error / Repeatability
ดูว่าการจ่ายซ้ำหลายครั้งให้ผลใกล้กันเพียงใด

Pipette อาจจ่ายซ้ำได้ใกล้กันมาก แต่ทุกครั้งคลาดจากค่าที่ต้องการในทิศทางเดียวกันก็ได้

ดังนั้นควรดูทั้งสองส่วนค่ะ

Pipette ผ่านการสอบเทียบ = ใช้งานได้ทุกงานหรือไม่?

ไม่จำเป็นค่ะ

Calibration บอก Performance ของ Pipette ภายใต้เงื่อนไขการสอบเทียบ

แต่การตัดสินว่า Pipette เหมาะกับงานหรือไม่ ต้องดู

Requirement ของ Method + Acceptance Criteria + Measurement Uncertainty + Volume ที่ใช้งานจริง

ร่วมกัน

เครื่องมือเดียวกันอาจเหมาะกับ Method หนึ่ง แต่ไม่เหมาะกับอีก Method ที่มี Tolerance แคบกว่าค่ะ

Pipette ต้องสอบเทียบทุก 1 ปีหรือไม่?

ไม่มี Calibration Interval เดียวที่เหมาะกับทุก Pipette

ควรพิจารณา

• • ความถี่ในการใช้
  • จำนวน Cycle
  • ความสำคัญของงาน
  • ประวัติ Calibration
  • ผล Intermediate Check
  • การตกหรือกระแทก
  • การซ่อม/เปลี่ยน Seal
  • สภาพการใช้งาน
  • Requirement ของระบบคุณภาพ

Pipette ที่ใช้ทุกวันกับ Pipette สำรองที่แทบไม่ได้ใช้งานอาจมีความเสี่ยงต่างกันค่ะ

Checklist ก่อนใช้ Pipette

ก่อนเริ่มงานควรตรวจอย่างน้อย Instrument ID และ Calibration Status, ช่วงปริมาตร, สภาพตัวเครื่อง, Plunger, Tip Cone, Tip ที่เหมาะสม, Volume Setting, การรั่วหรือความผิดปกติ, วิธี Pipetting ที่กำหนด และสภาพแวดล้อมที่เกี่ยวข้อง

หาก Pipette เพิ่งตก กระแทก หรือมีผลการจ่ายผิดปกติ ไม่ควรเพียงปรับ Volume แล้วใช้งานต่อ ควรตรวจสอบเพิ่มเติมก่อนค่ะ

สรุป

Pipette เป็นเครื่องมือวัดและจ่ายปริมาตรที่ความสามารถของผู้ใช้งานมีผลโดยตรงต่อผลที่ได้

การใช้งานที่น่าเชื่อถือไม่ได้ขึ้นอยู่กับ Pipette เพียงอย่างเดียว แต่เป็นระบบของ

Pipette + Tip + Liquid + Technique + Environment + User

จึงควรให้ความสำคัญกับการเลือก Pipette ให้เหมาะกับช่วงปริมาตร การติด Tip อย่างถูกต้อง การควบคุม Plunger ความลึกและมุมของ Tip อุณหภูมิ รวมถึงการสอบเทียบและติดตามสมรรถนะของเครื่องมือ

โดยเฉพาะงานที่ต้องการปริมาตรแม่นยำสูง การฝึกอบรมผู้ใช้ก็เป็นปัจจัยสำคัญ ซึ่ง ISO 8655-10:2024 ระบุทั้งแนวทางการใช้งาน การเลือกอุปกรณ์ และข้อกำหนดเรื่อง Training และ Competence ของผู้ใช้งานค่ะ ISO

แหล่งอ้างอิง

• ISO 8655-1:2022 — Piston-operated volumetric apparatus — Part 1: Terminology, general requirements and user recommendations ISO
• ISO 8655-2:2022 — Piston-operated volumetric apparatus — Part 2: Pipettes ISO
• ISO 8655-6:2022 — Gravimetric reference measurement procedure for the determination of volume ISO
• ISO 8655-8:2022 — Photometric reference measurement procedure for the determination of volume ISO
• ISO 8655-10:2024 — User guidance, and requirements for competence, training, and POVA suitability

บทความที่เกี่ยวข้อง

• Accuracy, Precision และ Resolution ต่างกันอย่างไร?
• Measurement Uncertainty คืออะไร?
• Acceptance Criteria คืออะไร?
• ต้องสอบเทียบเครื่องมือวัดทุก 1 ปีจริงหรือ?
• การทวนสอบเครื่องมือวัดระหว่างรอบสอบเทียบ (Intermediate Check)
• วิธีทวนสอบเครื่องมือวัดด้วยตนเอง ทำอย่างไรให้มั่นใจก่อนใช้งาน?
• Metrological Traceability คืออะไร?
• เลือกเครื่องมือวัดอย่างไรให้เหมาะกับงาน